CRISPR, la tecnica di editing genomico in grado di correggere le alterazioni a livello del DNA, si arricchisce di due nuove varianti che consentono di apportare modifiche alle singole basi nucleotidiche, i componenti fondamentali degli acidi nucleici. Il 25 ottobre scorso due gruppi di ricerca distinti ma entrambi afferenti al Broad Institute di MIT e Harvard a Cambridge, Massachusetts, hanno pubblicato le proprie scoperte su due prestigiose riviste scientifiche: il primo gruppo, guidato dal biologo chimico David Liu, ha presentato su Nature una nuova tecnica in grado di correggere il DNA; mentre il secondo team di ricerca, diretto dal neuroscienzato e bioingegnere Feng Zhang, noto per aver ottenuto per primo il brevetto di CRISPR, ha dimostrato l’efficacia di un nuovo metodo per l'editing genomico dell’RNA.

In entrambi i casi si tratta di adattamenti dell’ormai noto sistema CRISPR, ma anziché utilizzare le forbici molecolari per tagliare il DNA – col rischio di introdurre pericolose alterazioni come effetto collaterale – i nuovi strumenti hanno la capacità di modificare con alta efficienza le singole basi senza ricorrere a tagli del DNA. Il risvolto straordinario di questa abilità è che consentirebbe lo studio e il trattamento di tutte le malattie genetiche umane (circa il 50%) dovute ad una “mutazione puntiforme”, che dipendono cioè da un’aberrazione che coinvolge una singola base.

Già lo scorso anno Liu e colleghi annunciarono, sempre su Nature, di aver ideato un metodo di “base editing” che convertiva la base bersaglio in un’altra senza la necessità di aprire la doppia elica del DNA. All’epoca però il loro sistema era in grado di ottenere solo due tipi di conversioni chimiche: una citosina (C) in una timina (T) o una guanina (G) in una adenina (A). Nonostante questa limitazione, questo metodo venne utilizzato in tutto il mondo per la correzione dei geni di funghi, piante, pesci, topi e persino in esperimenti su embrioni umani.

Nell’ultimo lavoro lo stesso gruppo descrive il nuovo editor di basi nucleotidiche in grado di funzionare anche nell'altra direzione, convertendo T in C o A in G. La deaminazione spontanea della citosina è una delle principali fonti delle transizioni C • G a T • A; mentre la deaminazione dell'adenina produce inosina (I), che viene riconosciuta e trattata come guanina dalle polimerasi, ma non sono noti enzimi in grado di deaminare l'adenina nel DNA. I ricercatori hanno sviluppato un editor di base che agisce sull’adenina (adenine base editor – ABE) capace di operare la conversione A • T a G • C nel DNA genomico. Si tratta di una proteina ingegnerizzata creata dalla fusione di una adenosina deaminasi tRNA con un catalizzatore CRISPR-Cas9 che converte le coppie di base A • T a G • C con un’efficienza di ~ 50% nelle cellule umane, una purezza molto elevata (≥ 99,9%) e bassi tassi di inserzioni e delezioni (≤ 0.1%) cioè senza inserire o eliminare pezzi di DNA dal genoma trattato. Di conseguenza, la nuova tecnica risulta più adatta ad introdurre mutazioni puntiformi rispetto a un metodo basato sul nucleo Cas9 poiché lavora in modo più efficiente e pulito e introduce meno modificazioni del genoma fuori dal bersaglio.

Gli studiosi hanno testato in vitro l’editor ABE per verificarne la capacità di introdurre mutazioni che sopprimono la malattia e di correggere la mutazioni patogenetiche nelle cellule umane. Gli esperimenti, condotti su linee cellulari umane, hanno ottenuto circa il 30% di efficienza nell’inserimento di mutazioni nei geni HBG1 e HBG2, portando all’espressione dell’emoglobina fetale umana, una proteina che viene normalmente silenziata dopo la nascita ma che, se attiva, protegge il paziente da alcune malattie del sangue. Allo stesso modo la tecnica ABE è stata in grado di correggere la mutazione del gene HFE che causa un disordine ereditario nell’immagazzinamento del ferro a livello cellulare. Lo sviluppo di questo metodo amplia enormemente la possibilità di intervenire a livello puntiforme senza introdurre alterazioni e migliora la modifica del genoma consentendo l'introduzione diretta e programmabile di tutte le quattro mutazioni di transizione senza la scissione del DNA a doppio filamento.

L’altra tecnica di modificazione delle basi nucleotidiche presentata su dal gruppo di Zhang sfrutta anch’essa la conversione dell’adenina in inosina ma agisce sull’RNA anziché sul DNA. I ricercatori hanno creato una proteina di fusione unendo un enzima in grado di operare la trasformazione A • I con Cas13, un enzima che fa parte del sistema CRISPR ma che ha come obiettivo l’RNA. Questo sistema, denominato REPAIR (RNA Edit for Programmable A to I Replacement), che non ha vincoli di sequenza rigorosi, può essere utilizzato per modificare interi trascritti contenenti mutazioni patogene. Poiché l’RNA è stabile nella cellula solo per un breve periodo di tempo, questa metodica permette una correzione temporanea della mutazione bersaglio senza alterare il genoma in modo permanente.

Ciò rappresenta un'opzione potenzialmente più sicura rispetto a un intervento a carico del DNA poiché in questo caso un errore accidentale diverrebbe permanente. Utilizzare la tecnica di modifica dell’RNA significa anche che il trattamento dovrebbe essere somministrato ripetutamente. Ciò potrebbe rendere questo metodo meno attraente per le malattie genetiche che vedrebbero nella modifica permanente del DNA la totale guarigione dalla patologia; al contrario costituirebbe la terapia ideale per condizioni transitorie come l’infiammazione localizzata, mentre permetterebbe di adattare il trattamento clinico alle informazioni acquisite durante gli studi nel caso di patologie ancora poco studiate.

Entrambi i sistemi ABE e REPAIR rappresentano una promettente piattaforma di editing di singola base con ampia applicabilità per la ricerca, la terapia e la biotecnologia. Lo sviluppo di altri editor di base richiederà enzimi non presenti in natura, ma i due gruppi sono già all’opera per migliorare le proprie tecniche e crearne di nuove con sempre maggior specificità ed affidabilità.

Potrebbero volerci diversi anni prima che le terapie di modifica di singola base entrino negli studi clinici e ancor più per capire se questa strategia offre vantaggi rispetto alle terapie geniche esistenti. In questo momento è scientificamente scorretto concludere che questi sistemi possano costituire il modo migliore per attuare la terapia genetica umana; è già chiaro, però, che siamo di fronte a potenti alternative al metodo CRISPR standard.

Bibliografia:
- Gaudelli, N. M. et al. Nature (2017);
-  Cox, D. B. T. et al. Science (2017); 
- Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Nature 533, 420–424 (2016).